不同非洲猪瘟病毒实验室检测方法的对比

一、简介

非洲猪瘟（Africann Swine Fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）感染引起的家猪和野猪的一种急性、热性、高度接触性传染病¹。临床症状与猪瘟极其相似，以高热、皮肤发绀、内脏器官严重出血、呼吸障碍和神经症状为主要特征。本病传播快、致死率高，对养猪业危害巨大，是我国一类动物疫病和世界动物卫生组织（OIE）规定的必须报告的动物疫病，受到世界各国的高度重视²。本病是以节肢动物作为传播媒介的DNA病毒。ASF已在非洲、欧洲和美洲等几十个国家暴发，“三全水饺事件”则将非洲猪瘟直接推向大众的面前。目前，本病尚无有效的预防疫苗和治疗药物，防止疫情扩大的有效措施就是扑杀。因此事先建立简便、快速、准确的ASFV检测方法显得十分必要。本文就ASFV实验室检测的不同方法，进行对比分析。

二、检测方法

2.1 血清学检测方法

2.1.1酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA利用抗原抗体进行免疫反应的定性和定量检测，应用于血清抗体的检测，适用于大批量样品的检测。ASFV含有约150种蛋白，目前国内外常用作检测抗原的蛋白有VP73、VP72、P54、P32、P30等³。

优点：快速、方便。

缺点：（1）一般情况下, 非洲猪瘟病毒进入猪体内， 7天后才能诱导产生较高的Ig G抗体，而7天的时候，足以出现早期临床症状，并已经传染给其他家猪，因此该检测方法往往具有难以解决的滞后性。（2）针对不同蛋白会出现个别差异，增加排查的难度³。

2.1.2胶体金免疫层析（GICA）试纸条

运用双抗体夹心法原理纯化后的抗ASFV单克隆抗体制备金标抗体, 应用于检测ASFV的胶体金免疫层析试纸条，也称为检测卡。

优点：使用方便；

缺点：（1）灵敏度低；（2）一般情况下, 非洲猪瘟病毒进入猪体内， 7天后才能诱导产生较高的Ig G抗体，而7天的时候，足以出现早期临床症状，并已经传染给其他家猪，因此该检测方法往往具有难以解决的滞后性³。

2.1.3荧光抗体试验（FAT）

荧光抗体试验（FAT）可用于检测野外可疑猪或实验室接种猪的脾、淋巴结等组织压片和冰冻切片中的ASFV抗原。

优点：敏感性和特异性较佳；

缺点：需要专业试验人员，同时需要荧光显微镜及高质量的荧光标记抗体。因此仅作为ASFV的辅助检测方法⁴。

2.1.4免疫组化法

该方法用来检测急性感染ASFV猪的扁桃体组织病理学变化，通过检测发现，感染ASFV猪有出血、单核细胞增多现象。免疫组化法对于临床症状不明显的病例，确诊有一定难度，因此，该方法仅作为ASFV的辅助检测方法。

优点：特异性较佳；

缺点：对于临床症状不明显的病例，确诊有一定难度⁴。

2.2分子生物学检测方法

2.2.1 PCR

体外扩增基因的一种方法，是目前ASFV常用的实验室检测方法。研究表明，非洲猪瘟感染8小时， 便可从血液中检测到其核酸物质，因此针对非洲猪瘟病毒保守区域设计引物，对采集的血液或组织病料等相关物质进行DNA提取，进行PCR反应，可对其进行快速准确诊断。是目前ASFV常用的实验室检测方法。众多国内外研究^5-9均建立了ASFV的PCR检测方法，表明该方法具有良好的敏感性和特异性，且可以检测出极低含量的ASFV，为ASFV早期感染的快速诊断提供了有效的分子生物学检测方法。

优点：简单快速、灵敏度高和特异性强。

2.2.2 荧光定量PCR

通俗讲是PCR的升级版。实时荧光定量PCR比常规PCR具有更高的敏感性和特异性，可同时快速检测大批量样品，其更加敏感、准确。举例，McKillen等¹⁰（2010）根据9GL基因建立了MGB探针实时荧光定量PCR检测方法，低可以检测到20拷贝标准DNA。

优点：敏感性和特异性高。

2.2.3 探针杂交技术

能有效排除PCR检测过程中的非特异性结果， 省去了琼脂糖凝胶电泳步骤，操作简便、检测迅速，在酶标板中可批量反应，为ASFV核酸检测方法开辟了新的途径，

该方法的建立难度较高、操作较繁琐， 对实验人员技术水平要求较高。

三、小结

• 目前，ASFV的检测技术主要有针对病毒DNA的核酸检测技术和基于病毒抗原、抗体反应的免疫学技术两大类。
• OIE推荐检测ASFV的方法主要有PCR、实时荧光定量PCR、ELISA等。用免疫学方法检测抗体可以了解ASFV感染、发生、发展的进程，但抗体只有在病毒感染至一定时期后才会出现，故ELISA等抗体检测方法存在一定的局限性和滞后性。
• PCR、实时荧光定量PCR等分子生物学技术在猪感染ASFV的早期即可检测到病毒核酸，在ASFV的早期检测中具有重要作用。
• 总之，ASFV的实验室检测方法多种多样，但若要求检测结果准确、快速、敏感，我们推荐PCR、实时荧光定量PCR的方法，这不仅对感染ASFV的动物治疗非常重要，而且对未感染的动物及时采取有效的预防措施同样具有重要的意义。

• 随着免疫学与分子生物学技术的不断发展，ASFV的实验室检测方法必将不断完善，进一步为我国开展ASF的监测与综合防控提供技术支持。

【参考文献】

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